Contenu
- Fusion! Fusion!
- Fermetures à glissière magnétiques
- Des aimants plus puissants collent plus étroitement
- Le point intermédiaire
La réaction en chaîne de la polymérase, ou PCR, est une technique qui permet de photocopier un fragment d’ADN en plusieurs fragments, de manière exponentielle. La première étape de la PCR consiste à chauffer l’ADN de manière à ce qu’il se dénature ou se dissolve en un seul brin. La structure de l'ADN ressemble à une échelle de corde dans laquelle les échelons sont des cordes avec des extrémités magnétiques. Les aimants se connectent pour former les barreaux, appelés paires de bases, et résistent ainsi à la séparation. Chaque fragment d'ADN fond en un seul brin à des températures différentes. Comprendre comment les différentes parties de l’ADN maintiennent la structure de l’ADN permet de comprendre pourquoi différents fragments d’ADN fondent à des températures différentes et pourquoi des températures aussi élevées sont nécessaires.
Fusion! Fusion!
La première étape de la PCR consiste à faire fondre l'ADN afin que l'ADN double brin se sépare en ADN simple brin. Pour l’ADN de mammifère, cette première étape implique généralement une chaleur d’environ 95 degrés Celsius (environ 200 Fahrenheit). À cette température, les liaisons hydrogène entre les paires de bases A-T et G-C, ou les barreaux dans l’échelle de l’ADN, se séparent, décomposant ainsi l’ADN double brin. Cependant, la température n’est pas assez chaude pour casser l’épine dorsale phosphate-sucre qui forme les brins simples, ou les pôles de l’échelle. La séparation complète des brins simples les prépare à la deuxième étape de la PCR, qui est refroidie pour permettre à de courts fragments d’ADN, appelés amorces, de se lier aux brins simples.
Fermetures à glissière magnétiques
Une des raisons pour lesquelles l’ADN est chauffé à une température élevée de 95 degrés Celsius est que plus le double brin d’ADN est long, plus il souhaite rester ensemble. La longueur de l'ADN est un facteur qui influe sur le point de fusion choisi pour la PCR sur cette partie de l'ADN. Les paires de bases A-T et G-C dans la liaison ADN double brin les unes aux autres pour maintenir la structure double brin ensemble. Plus le nombre de paires de bases consécutives entre deux brins simples est lié, plus leurs voisins veulent également se lier, et plus l'attraction entre les deux brins devient forte. C'est comme une fermeture à glissière faite de petits aimants. Lorsque vous fermez la fermeture à glissière, les aimants voudront naturellement se fermer et rester zippés.
Des aimants plus puissants collent plus étroitement
Un autre facteur qui affecte la température de fusion à choisir pour votre fragment d'ADN d'intérêt est la quantité de paires de bases G-C présentes dans ce fragment. Chaque paire de base est comme deux mini-aimants qui attirent. Une paire composée de G et C est beaucoup plus attirée qu'une paire A et T. Ainsi, un fragment d’ADN contenant plus de paires de G-C qu’un autre fragment nécessitera une température plus élevée avant de se fondre en un seul brin. L'ADN absorbe naturellement la lumière ultraviolette - à la longueur d'onde de 260 nanomètres, pour être exact - et l'ADN simple brin absorbe plus de lumière que l'ADN double brin. Donc, mesurer la quantité de lumière absorbée est un moyen de mesurer à quel point votre ADN double brin a fondu en simples brins. L'effet de "fermeture à glissière magnétique" des paires de bases G-C et A-T est ce qui fait qu'un graphique de l'absorbance lumineuse de l'ADN double brin tracé en fonction d'une augmentation de la température est sigmoïdal, en forme de S et non en ligne droite. La courbe du S représente la résistance au travail d’équipe que les paires de bases exercent contre la chaleur car elles ne veulent pas se séparer.
Le point intermédiaire
La température à laquelle une longueur d'ADN fond en un seul brin s'appelle sa température de fusion, désignée par l'abréviation «Tm». Elle indique la température à laquelle la moitié de l'ADN d'une solution a fondu en un seul brin et l'autre moitié est toujours sous forme de double brin. La température de fusion est différente pour chaque fragment d'ADN. L'ADN de mammifère a une teneur en G-C de 40%, ce qui signifie que les 60% restants des paires de bases sont As et Ts. Sa teneur en G-C à 40% fait fondre l’ADN des mammifères à 87 degrés Celsius (environ 189 Fahrenheit). C'est pourquoi la première étape de la PCR sur l'ADN de mammifère consiste à le chauffer à 94 degrés Celsius (201 Fahrenheit). Seulement sept degrés plus chaud que la température de fusion et tous les doubles brins fondront complètement à simple brins.