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La chromatographie en phase liquide à haute performance est une technique d'analyse en laboratoire d'un mélange. C'est un type de chromatographie efficace qui utilise la haute pression, plutôt que la simple gravité, pour propulser un échantillon d'un mélange à travers une colonne. Un échantillon est injecté, puis une pompe à haute pression aide à déplacer l’échantillon le long d’une colonne remplie, où il est séparé en composants individuels. Cette séparation est ensuite analysée par un détecteur pour donner des résultats.
Site d'injection
Pour être injecté dans une HPLC, un échantillon doit d'abord être dissous dans un solvant liquide polaire, de préférence avec des spectres de HPLC connus, afin que ses données puissent être distinguées des échantillons. La solution liquide contenant l'échantillon est placée dans l'instrument et envoyée dans la colonne. L'emplacement réel du site d'injection dépend de la marque des instruments. Dans la plupart des cas, le processus d'injection est automatisé, mais dans certains cas, un employé de laboratoire doit injecter l'échantillon à l'aide d'une petite aiguille de seringue.
Composant de la pompe
Le composant pompe de l'unité HPLC est nécessaire car il fournit la pression qui propulse l'échantillon dans la colonne. La force de la pompe varie, mais une pression puissante peut produire une pression pouvant atteindre 6 000 psi, ou livres par pouce carré, appliquée après l’injection de l’échantillon. Cela permet à l'échantillon de traverser la colonne plus rapidement et efficacement que s'il coulait en utilisant uniquement la force de gravité.
Description de la colonne
L'augmentation de la vitesse d'un échantillon passé à travers la colonne par une pompe permet d'utiliser un type de colonne différent de celui utilisé en chromatographie liquide simple. Le matériau de garnissage dans la colonne peut avoir une taille de particules beaucoup plus petite, ce qui augmente la surface et facilite donc les interactions de l'échantillon avec la colonne. La plupart des colonnes HPLC fonctionnent par polarité. L'échantillon est dissous dans un solvant polaire et la colonne est composée en grande partie d'hydrocarbures non polaires. Les parties polaires de la molécule échantillon traversent la colonne très rapidement car elles interagissent principalement avec le solvant, tandis que les composants non polaires des échantillons persistent dans la colonne, créant de faibles interactions avec les composants de la colonne. Par conséquent, les composants des échantillons sortent de la colonne dans l'ordre, des plus polaires aux plus non polaires.
Fonction de détecteur
Les détecteurs varient également en fonction du type d'instrument HPLC utilisé. Cependant, la plupart fonctionnent de la même manière. Une source de lumière ultraviolette brille sur les composants de l'échantillon séparés lorsqu'ils sortent de la colonne. La plupart des composés organiques absorbent une certaine quantité de lumière. Ainsi, lorsqu'ils passent devant le faisceau lumineux appliqué, un détecteur peut capter la quantité de lumière absorbée. Le détecteur enregistre également le temps de rétention des composants en fonction de leur ordre de sortie de la colonne. Cette sortie peut ensuite être analysée en fonction de la surface du pic pour déterminer la nature exacte des composants de l'échantillon.