Contenu
- Clonage d'ADN: définition et processus
- La méthode du vecteur plasmidique
- La méthode PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Utilisation conjointe des méthodes de vecteur plasmidique et de clonage d'ADN PCR
- Exemples de clonage d'ADN pour la biotechnologie
- Exemples de clonage d'ADN pour la recherche
- Exemples de clonage d'ADN pour la thérapie génique
Il est possible de cloner des organismes entiers tels que Dolly le mouton, mais le clonage de l'ADN est différent. Il utilise des techniques de biologie moléculaire pour copies identiques de séquences d'ADN ou de gènes simples.
À l'aide de méthodes de génie génétique, des segments du code génétique de l'ADN sont identifiés et isolés. Le clonage d'ADN copie ensuite les séquences d'acide nucléique dans les segments.
Les copies identiques obtenues peuvent être utilisées pour des recherches ultérieures ou pour des applications en biotechnologie. Souvent, le gène copié code pour une protéine pouvant faire partie de traitements médicaux. Technologie de l'ADN incluant Clonage d'ADN soutient la compréhension du fonctionnement des gènes et de l’influence du code génétique de l’homme sur le fonctionnement du corps.
Clonage d'ADN: définition et processus
Le clonage d'ADN est le processus de biologie moléculaire consistant à créer des copies identiques de segments d'ADN situés dans les chromosomes contenant le code génétique d'organismes avancés.
Le processus génère de grandes quantités de séquences d'ADN cibles. L'objectif du clonage de l'ADN est de produire les séquences d'ADN cibles elles-mêmes ou de produire les protéines codées dans les séquences cibles.
Les deux méthodes utilisées dans le clonage de l'ADN sont appelées vecteur plasmidique et réaction en chaîne de la polymérase (PCR). dans le vecteur plasmidique méthode, les brins d’ADN sont coupés en utilisant les enzymes de restriction pour produire des fragments d'ADN, et les segments résultants sont insérés dans des vecteurs de clonage appelés plasmides pour une duplication supplémentaire. Les plasmides sont placés dans des cellules bactériennes qui produisent ensuite les copies d'ADN ou les protéines codées.
dans le Méthode PCR, le segment de brins d’ADN à dupliquer est marqué par des enzymes appelées amorces. Une enzyme polymérase fait des copies de la partie marquée du brin d’ADN. Cette méthode n'utilise pas d'enzymes de restriction et peut produire de l'ADN cloné à partir de petits échantillons. Parfois, les deux méthodes de technologie ADN sont utilisées ensemble pour incorporer les meilleures caractéristiques de chacune d’elles dans une réaction globale.
La méthode du vecteur plasmidique
Le vecteur de la méthode fait référence au plasmide utilisé pour contenir le segment d'ADN cible à cloner. Les plasmides sont de petits brins circulaires de ADN non chromosomique trouvé dans de nombreux organismes, y compris les bactéries et les virus.
Les plasmides bactériens sont le vecteur utilisé pour insérer le segment d'ADN cible dans des cellules bactériennes en vue d'une duplication supplémentaire.
Sélection et isolement de l'ADN cible: Avant que le processus de clonage de l'ADN puisse commencer, les séquences de l'ADN doivent être identifiées, en particulier les débuts et les extrémités des segments d'ADN.
Ces séquences d'ADN peuvent être trouvées en utilisant l'ADN cloné existant avec des séquences connues ou en étudiant la protéine produite par la séquence d'ADN cible. Une fois la séquence connue, les enzymes de restriction correspondantes peuvent être utilisées.
Couper l'ADN cible avec des enzymes de restriction: Les enzymes de restriction sont sélectionnées pour rechercher le code ADN au début et à la fin des séquences cibles.
Lorsque les enzymes de restriction trouvent une séquence codée spéciale de paires de bases appelée sites de restriction, elles se fixent à l'ADN à cet emplacement et s'enroulent autour de la molécule d'ADN, coupant le brin. Les segments d'ADN coupés contenant la séquence cible sont maintenant disponibles pour la duplication.
Choisir le vecteur plasmidique et insérer l'ADN cible: Un plasmide approprié contient idéalement les mêmes séquences codant l'ADN que le brin d'ADN à partir duquel l'ADN cible a été coupé. Le brin d'ADN circulaire du plasmide est coupé avec les mêmes enzymes de restriction que celles utilisées pour couper l'ADN cible.
UNE ADN ligase est utilisé pour promouvoir la liaison de segments d'ADN et les extrémités du segment d'ADN cible se lient aux extrémités coupées de l'ADN plasmidique. L'ADN cible fait maintenant partie du brin d'ADN plasmidique circulaire.
Insertion du plasmide dans une cellule bactérienne: Une fois que le plasmide contient la séquence d’ADN à cloner, le clonage lui-même peut avoir lieu en utilisant un processus appelé transformation bactérienne. Les plasmides sont insérés dans une cellule bactérienne telle que E. coli et les cellules contenant les nouveaux segments d'ADN commenceront à produire des copies et les protéines correspondantes.
Dans la transformation bactérienne, les cellules hôtes et les plasmides sont incubés ensemble à la température du corps pendant environ 12 heures. Les cellules absorbent une partie des plasmides et les traitent comme leur propre ADN plasmidique.
Récolte de l'ADN cloné et des protéines: La plupart des plasmides utilisés pour le clonage de l'ADN ont gènes de résistance aux antibiotiques incorporés dans leur ADN. Lorsque les cellules bactériennes absorbent les nouveaux plasmides, elles deviennent résistantes aux antibiotiques.
Lorsque la culture est traitée avec des antibiotiques, seules les cellules ayant absorbé les nouveaux plasmides survivent. Le résultat est une culture pure de cellules bactériennes avec de l'ADN cloné. Cet ADN peut ensuite être récolté ou la protéine correspondante peut être produite.
La méthode PCR (Polymerase Chain Reaction)
La méthode PCR est plus simple et copie l'ADN existant en place. Il n'est pas nécessaire de couper avec des enzymes de restriction ou d'insérer des séquences d'ADN plasmidique. Cela le rend particulièrement adapté au clonage d'échantillons d'ADN avec un nombre limité de brins d'ADN. Bien que la méthode puisse cloner l’ADN, elle ne peut pas être utilisée pour la production de la protéine correspondante.
Dérouler les brins d'ADN: L'ADN dans les chromosomes est étroitement enroulé dans une structure à double hélice. Chauffer l'ADN à 96 degrés Celsius dans un processus appelé dénaturation rend la molécule d'ADN dérouler et se séparer en deux brins. Cette séparation est nécessaire car un seul brin d’ADN peut être cloné à la fois.
Sélection des amorces: Comme pour le clonage d'ADN de vecteur plasmidique, les séquences d'ADN à cloner doivent être identifiées avec un accent particulier sur les débuts et les extrémités des segments d'ADN. Les amorces sont des enzymes qui se lient à des séquences de code ADN spécifiques et doivent être sélectionnées pour marquer les segments d'ADN cibles. Les bonnes amorces seront attachées aux séquences de molécules d'ADN pour marquer les débuts et les extrémités des segments cibles.
Recuit de la réaction pour lier les amorces: On appelle refroidissement la réaction à environ 55 degrés Celsius. recuit. Lorsque la réaction refroidit, les amorces sont activées et se fixent au brin d'ADN à chaque extrémité d'un segment d'ADN cible. Les amorces agissent uniquement en tant que marqueurs et le brin d'ADN n'a pas besoin d'être coupé.
Produire des copies identiques du segment d’ADN cible: Dans un processus appelé extension, l'enzyme polymérase TAQ thermosensible est ajoutée à la réaction. La réaction est ensuite chauffée à 72 degrés Celsius, activant l'enzyme. L'enzyme ADN polymérase active se lie aux amorces et copie la séquence d'ADN entre elles. Le processus initial de séquençage et de clonage de l’ADN est terminé.
Augmenter le rendement en ADN cloné: Le processus de recuit et d’extension initial crée relativement peu de copies des segments de brin d’ADN disponibles. Pour augmenter le rendement grâce à une réplication supplémentaire de l'ADN, la réaction est à nouveau refroidie pour réactiver les amorces et les laisser se lier à d'autres brins d'ADN.
Ensuite, le réchauffage de la réaction active à nouveau l'enzyme polymérase et produit davantage de copies. Ce cycle peut être répété 25 à 30 fois.
Utilisation conjointe des méthodes de vecteur plasmidique et de clonage d'ADN PCR
La méthode du vecteur plasmidique repose sur un important apport initial d’ADN à couper et à insérer dans les plasmides. Trop peu d'ADN original entraîne moins de plasmides et un lent démarrage de la production d'ADN cloné.
La méthode PCR peut produire une grande quantité d’ADN à partir de quelques brins d’ADN originaux, mais comme l’ADN n’est pas implanté dans une cellule bactérienne, la production de protéines n’est pas possible.
Pour produire la protéine codée dans les fragments d’ADN à cloner à partir d’un petit échantillon d’ADN initial, les deux méthodes peuvent être utilisées ensemble. se complètent. Tout d'abord, la méthode PCR est utilisée pour cloner l'ADN d'un petit échantillon et produire de nombreuses copies.
Ensuite, les produits de PCR sont utilisés avec la méthode du vecteur plasmidique pour implanter l'ADN produit dans des cellules bactériennes qui produiront la protéine souhaitée.
Exemples de clonage d'ADN pour la biotechnologie
La biologie moléculaire utilise le clonage de gènes et la réplication de l'ADN à des fins médicales et commerciales. Les bactéries contenant des séquences d'ADN clonées sont utilisées pour produire des médicaments et remplacer des substances que les personnes souffrant de troubles génétiques ne peuvent pas produire elles-mêmes.
Les utilisations typiques incluent:
La biotechnologie utilise également le clonage de gènes en agriculture pour créer de nouvelles caractéristiques chez les plantes et les animaux ou améliorer les caractéristiques existantes. À mesure que davantage de gènes sont clonés, le nombre d'utilisations possibles augmente de manière exponentielle.
Exemples de clonage d'ADN pour la recherche
Les molécules d'ADN constituent une petite fraction du matériel dans une cellule vivante et il est difficile d'isoler les influences de nombreux gènes. Les méthodes de clonage d'ADN fournissent de grandes quantités d'une séquence d'ADN spécifique à étudier, et l'ADN produit des protéines exactement comme il le faisait dans la cellule d'origine. Le clonage de l'ADN permet d'étudier cette opération pour différents gènes isolés.
Les applications typiques de la recherche et de la technologie ADN incluent:
Lorsque plus de séquences d'ADN sont clonées, il est plus facile de trouver et de cloner des séquences supplémentaires. Les segments d'ADN clonés existants peuvent être utilisés pour déterminer si un nouveau segment correspond à l'ancien et quelles parties sont différentes. L'identification d'une séquence d'ADN cible est alors plus rapide et plus précise.
Exemples de clonage d'ADN pour la thérapie génique
Dans thérapie génique, un gène cloné est présenté aux cellules d’un organisme dont le gène naturel est endommagé. Un gène vital qui produit une protéine requise pour une fonction d'organisme spécifique pourrait être muté, modifié par une radiation ou affecté par des virus.
Lorsque le gène ne fonctionne pas correctement, il manque une substance importante dans la cellule. La thérapie génique tente de remplacer le gène par une version clonée qui produira la substance requise.
La thérapie génique est encore expérimentale et peu de patients ont été guéris par cette technique. Le problème réside dans l'identification du seul gène responsable d'une affection médicale et dans la délivrance de nombreuses copies du gène aux cellules appropriées. Alors que le clonage de l'ADN s'est généralisé, la thérapie génique a été appliquée dans plusieurs situations spécifiques.
Les applications récemment retenues incluent:
La thérapie génique est l'une des applications les plus prometteuses du clonage d'ADN, mais d'autres nouvelles utilisations vont probablement proliférer à mesure que davantage de séquences d'ADN sont étudiées et que leur fonction est déterminée. Le clonage d'ADN fournit la matière première nécessaire au génie génétique dans les quantités nécessaires.
Lorsque le rôle des gènes est connu et que leur bon fonctionnement peut être assuré par le remplacement de gènes défectueux, de nombreuses maladies chroniques et même le cancer peuvent être attaqués et traités au niveau génétique à l'aide de la technologie de l'ADN.
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