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En électrophorèse sur gel, les échantillons d'ADN ou de protéines sont séparés - généralement en fonction de la taille - en appliquant un champ électrique qui les fait migrer à travers un gel. L'électrophorèse sur gel est courante dans les laboratoires de recherche biomédicale et permet de répondre à une variété de questions. Il n'existe donc pas de moyen universel d'analyser les résultats.
Différentes techniques telles que le Western blot, le Northern blot et le Southern blot, par exemple, impliquent toutes une électrophorèse sur gel.
Si vous effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose sur des échantillons d’ADN, le type le plus courant de procédure, vous devrez généralement faire au moins deux choses: 1) distinguer les plasmides non coupés des inserts, des plasmides à coupures et des plasmides coupés et, 2) estimer la taille des divers plasmides. Fragments d'ADN avec une courbe standard Excel ou une calculatrice.
Voilà comment cela fonctionne.
Vérifiez votre cahier de laboratoire pour déterminer quels échantillons ont été chargés dans quelles voies. Lorsque vous avez chargé les puits pour votre gel, vous devriez avoir noté l'identité de chaque voie / échantillon.
Déterminez quelle voie contient "l'échelle" des standards ADN. Ce sont des fragments de longueur connue; Leur distance de migration peut être utilisée pour déterminer la taille des fragments d'échantillon à l'aide d'une courbe standard Excel ou d'une autre calculatrice.
À l’aide d’une règle, mesurez la distance sur votre image entre les puits et le colorant de suivi, qui aura parcouru plus de distance que n’importe laquelle des bandes d’ADN (en d’autres termes, elle se trouvera au bas du gel). Notez ce nombre - les unités que vous utilisez ne sont pas importantes.
Mesurez la distance sur votre image des puits à chacune des bandes de "l'échelle", puis divisez cette distance par la distance parcourue par la bande de colorant de suivi. Ce calcul vous donne la mobilité relative de chaque bande.
Exemple: supposons que la bande de colorant de suivi ait parcouru 6 pouces et que nous ayons trois bandes qui ont parcouru 5, 4,5 et 3,5 pouces.
Quelle est leur mobilité relative? Réponse: Nous divisons 5, 4,5 et 3,5 par 6 pour obtenir des mobilités relatives de 0,833, 0,75 et 0,5833.
Entrez les mobilités relatives dans votre tableur (Excel ou tout autre programme similaire que vous utilisez) ainsi que la taille en kilobases de chaque fragment de l'échelle.
Le fabricant vous donne la taille de chaque fragment dans les échelles fournies, vous devriez donc déjà avoir cette information.
Représentez graphiquement les données avec une mobilité relative sur le x et la taille en kilobases sur le y.
Utilisez la fonction Trendline de votre tableur pour ajuster une équation aux données. Cette équation doit être une équation de puissance (par exemple, x ^ -2) et s’ajuster assez bien aux données (coefficient R d’au moins 0,9). Cela crée une courbe et une courbe standard Excel.
Regardez les bandes correspondant à vos échantillons.
N'oubliez pas que les plus petits fragments d'ADN traversent le gel plus loin que les grands, de sorte que ceux qui se rapprochent le plus du colorant de suivi seront les plus petits. Notez cependant que si l’ADN plasmidique (circulaire) est non coupé, il deviendra "super enroulé" ou tordu comme un cordon téléphonique, ce qui le fera voyager plus loin que l'ADN linéaire de la même taille.
De même, un plasmide «coupé» qui a été coupé de manière incomplète voyagera plus court distance que l'ADN linéaire de la même taille. Par conséquent, vous ne pouvez pas estimer la taille des plasmides non coupés de votre gel.
Faites correspondre les bandes de chaque piste avec l'identité de l'échantillon que vous avez chargé dans cette piste et déterminez si ce que vous voyez correspond à ce que vous auriez prévu. Cela dépendra de la nature de votre expérience.
En général, cependant, si vous avez digéré un plasmide inséré avec deux enzymes de restriction, vous vous attendriez à ce que l'insert soit libéré du plasmide.
Comme il est beaucoup plus petit que le plasmide, vous vous attendriez à voir deux bandes dans cette piste, une vers le haut et l’autre vers le bas. Un plasmide coupé avec une seule enzyme de restriction ne devrait former qu'une seule bande se déplaçant un peu plus loin que le plasmide coupé avec deux enzymes de restriction, mais loin de l'insert.
Mesurez la distance entre les puits et le plasmide coupé et insérez des bandes avec votre règle. Divisez ces nombres par la distance parcourue par le colorant de suivi pour trouver la mobilité relative des inserts et des plasmides coupés.
Branchez la mobilité relative des inserts et coupez les plasmides dans l’équation calculée par votre tableur. Ce calcul devrait vous donner une estimation de la taille de ces plasmides.