Selon le site Web de l'Université du Wisconsins BioWeb, une amorce PCR est un oligonucléotide synthétique de courte durée (généralement entre 18 et 25 bases) utilisé pour amplifier des régions spécifiques de l'ADN dans une technique de biologie moléculaire appelée réaction en chaîne par polymérase (PCR). Une amorce directe et une amorce inverse sont nécessaires, conçues pour être des compléments inverses du brin d'ADN, pour flanquer et se lier à la région d'ADN souhaitée. Lorsque les scientifiques souhaitent effectuer des recherches sur un gène ou une région spécifique de l’ADN, ils doivent d’abord effectuer une PCR afin d’acquérir suffisamment de région cible sur laquelle travailler. Il peut être nécessaire de concevoir des séquences d’amorces pour la région d’intérêt si elles ne sont pas déjà disponibles au moyen de recherches publiées antérieurement ou par des moyens commerciaux.
Obtenez la séquence nucléotidique du gène ou de la région d’ADN d’intérêt et décidez combien de temps un fragment vous souhaitez amplifier. L'amorce directe et inverse est conçue pour se lier au début et à la fin du fragment souhaité. En règle générale, les méthodes PCR classiques utilisent des amorces qui flanquent une région longue de 100 à 1 000 paires de bases, tandis que les méthodes PCR en temps réel utilisent des fragments longs d'environ 50 à 200 paires de bases.
Décidez où vous voulez placer les amorces dans l’ordre. Par exemple, vous souhaiterez peut-être un emplacement proche de l'extrémité 5 ou 3 de la séquence ou au milieu. Si vous le souhaitez, indiquez l'emplacement des amorces pour qu'elles s'étendent sur un intron.
Suivez les directives recommandées pour la conception des apprêts. L'amplification réussie du produit ADN dépend de la qualité des amorces et certaines variables sont essentielles.
Les apprêts de conception doivent avoir une longueur de 18 à 24 bases. Vincent R. Prezioso, Ph.D., de Brinkmann Instruments Inc., suggère que cette longueur est suffisamment longue pour être extrêmement spécifique à la région d'ADN souhaitée, mais suffisamment courte pour se lier facilement (anneler). La température de fusion de l’amorce (Tm) doit être comprise entre 55 et 80 degrés Celsius, suffisamment basse pour permettre une fusion complète égale ou supérieure à 90 degrés Celsius, mais suffisamment élevée pour permettre un recuit. La teneur en GC (pourcentage de G et de C dans la séquence) doit être comprise entre 40 et 60%. L’extrémité 3 de la séquence d’amorce doit se terminer par un C ou un G (appelé pince GC) pour favoriser la liaison, car les nucléotides G et C ont des liaisons plus fortes; toutefois, évitez d’avoir trois ou plus de G ou C dans les cinq dernières bases. de la séquence.
Évitez les analyses de quatre ou plus d'une base (comme ACCCC ...) ou de quatre répétitions di-nucléotides ou plus (telles qu'ATATATAT ...), car elles peuvent provoquer une erreur d'amorce.Des amorces de conception sans homologie intra-amorce (plus de trois bases qui se complètent dans une amorce elle-même) ou homologie inter-amorce (où l'amorce directe et inverse ont des séquences complémentaires). Cela peut provoquer des auto-dimères ou des amorces-dimères, où les amorces se lient à elles-mêmes au lieu de se lier à la séquence d'ADN souhaitée.
Utilisez des ressources en ligne et des sites Web qui facilitent la conception des apprêts ou aidez à vérifier l'auto-complémentarité des séquences d'amorces ou la possibilité de créer des structures secondaires telles que des épingles à cheveux. Parmi les sites Web de conception d'amorces, citons Primer3 du Massachusetts Institute of Technologys, Centre national d'information sur la biotechnologie, Primer-Blast et OligoAnalyzer, technologies à ADN intégré.