Contenu
Une fois que vous avez analysé des échantillons d’ADN sur un gel d’agarose et pris une photo, vous pouvez enregistrer la photo pour plus tard. Vous pourrez ensuite analyser les résultats et les interpréter. Le genre de choses que vous recherchez dépendra de la nature de votre expérience. Si vous faites du doigté ADN, par exemple, vous voudrez peut-être comparer la taille des morceaux d’ADN de deux échantillons - du suspect et d’un échantillon de scène de crime. Si vous travaillez avec des plasmides de bactéries, par contre, vous devrez peut-être vous assurer que le plasmide contient l'insert. Par conséquent, la façon dont vous interprétez votre gel dépendra en partie de l'expérience que vous avez faite. Néanmoins, vous pouvez appliquer certaines règles générales.
En partant du haut de l'image, mesurez la distance qui sépare chaque bande de la piste "Standards" de votre gel (ou l'échelle). La piste des normes contient des fragments d’ADN dont la taille est déjà connue. Vous devez donc connaître leur taille avant de commencer votre expérience. Mesurez également la distance parcourue par les bandes dans chacune des voies de l'échantillon.
Divisez la distance de chaque étalon et de chaque bande dans les échantillons parcourus par la distance jusqu'au fond du gel. Le résultat s'appelle la mobilité relative. Vous pouvez utiliser le programme de feuille de calcul pour effectuer l’arithmétique à votre place s’il accélère cette étape.
Entrez la mobilité relative et la taille de chaque norme dans votre tableur, puis utilisez l'outil graphique de votre tableur pour créer un graphique de ces données avec une mobilité relative sur l'axe des x et une taille sur le y.
Ajustez une ligne au graphique à l'aide d'une régression non linéaire. Consultez la section d'aide de votre tableur si vous avez besoin de savoir comment procéder. Vous devriez vous retrouver avec une équation, peut-être semblable à la suivante:
y = (0,3) x ^ -2,5
Notez que x ici sera la mobilité relative, alors que y est la taille. Notez également que votre équation peut avoir des nombres complètement différents pour l'exposant et le coefficient - cette équation est simplement fournie à titre d'exemple hypothétique.
Prenez la mobilité relative des bandes de votre échantillon et branchez-la en tant que x pour calculer la taille des pièces d'ADN dans les bandes de l'échantillon.
Supposons que l'équation obtenue par votre tableur soit bien y = (0,3) x ^ -2,5 et que la mobilité relative d'une bande de sondage particulière était de 0,68. En substituant 0,68 dans votre équation, vous trouvez ce qui suit:
y = (0,3) (0,68) ^ - 2,5
En utilisant votre calculatrice, vous relancez 0,68 à -2,5 et vous obtenez les éléments suivants:
y = (0,3) (2,62)
y = 0,786
qui serait alors la taille estimée en kilobases de l’ADN dans l’une des bandes de votre échantillon.
Les plasmides
Notez que vous pouvez ou non utiliser les instructions de cette section. L'électrophorèse sur gel d'agarose est souvent utilisée pour confirmer qu'un plasmide contient un insert donné. Si vous ne travaillez pas avec des plasmides, vous pouvez ignorer cette section. Si vous êtes, cependant, vous pouvez suivre ces instructions.
Notez que si vous travaillez avec des plasmides non coupés ou coupés, vous ne pouvez pas estimer la taille en utilisant la procédure de la section 1 ci-dessus. C'est parce que les plasmides non coupés et coupés migrent à des vitesses différentes de celles de l'ADN linéaire.
Comparez le nombre de bandes dans chaque piste. Rappelons qu'une enzyme de restriction coupe l'ADN au niveau de sites où se produit une séquence donnée appelée site de restriction. Si un échantillon a été traité avec deux enzymes de restriction, une bande pour l'insert et une bande pour le reste du plasmide doivent être présentes. C'est parce que l'insert sera flanqué de deux sites de restriction, chacun pour une enzyme différente, de sorte que des coupures sur ces deux sites libéreront l'insert du plasmide. En revanche, une coupure sur un seul site convertira le plasmide en ADN linéaire. Un échantillon coupé sans enzymes de restriction ou une enzyme de restriction devrait alors comporter une seule bande, tandis qu'un échantillon coupé avec deux enzymes de restriction devrait comporter deux bandes.
Recherchez les bandes créées par l’ADN plasmidique surnommé. Un plasmide coupé a une coupe dans un seul brin, il migre donc plus lentement qu'un plasmide coupé. Les plasmides coupés migrent à leur tour plus lentement que l'ADN non coupé.
Estimez la taille de l’insert à l’aide de la procédure décrite à la section 1 et déterminez si elle correspond à vos attentes (ce qui varie en fonction de l’expérience.)