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Lorsque vous travaillez avec la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), une bonne calibration est absolument essentielle pour garantir des résultats fiables et de qualité. L'étalonnage correct d'un instrument HPLC commence par la création d'un étalon d'étalonnage approprié. Dans la plupart des cas, l'étalonnage nécessite en fait une série d'étalons à concentration croissante afin de produire ce que l'on appelle une courbe d'étalonnage. Il s’agit d’un trait tracé et d’une équation associée décrivant la relation entre la concentration du produit chimique testé et la réponse du détecteur HPLC.
Déterminez le produit chimique que vous souhaitez tester pour l’utilisation de la CLHP ("analyte"). Par exemple, vous pouvez tester une série de boissons non alcoolisées pour déterminer leur teneur en fructose, auquel cas le fructose serait l’analyte.
Obtenir une quantité de la substance chimique à analyser de pureté appropriée. Normalement, la pureté doit être supérieure à 99% et l'analyte doit être acheté auprès d'une entreprise de produits chimiques réputée. Dans le cas du fructose, par exemple, vous achèteriez du fructose pur auprès d'un vendeur de produits chimiques et non pas d'une épicerie.
Déterminez les concentrations maximales et minimales prévues de l'analyte dans les échantillons que vous souhaitez tester sur la CLHP. Dans le cas des boissons non alcoolisées, vous examinerez les étiquettes des boissons et déterminerez la teneur en fructose la plus faible et la plus élevée parmi les boissons que vous testerez. N'oubliez pas que l'échantillon initial (la boisson sans alcool) peut être dilué ou manipulé de toute autre manière pendant la préparation en vue de l'analyse (en fonction de la méthode HPLC utilisée) et que la concentration en analyte dans les échantillons réellement injectés dans la CLHP peut être modifiée. C'est la concentration en analyte dans les échantillons telle qu'analysée par HPLC qui doit être prise en compte.
Déterminez le solvant dans lequel vous allez dissoudre votre analyte pour constituer des standards d’étalonnage. Ce solvant doit pouvoir dissoudre correctement l'analyte sur une plage de concentrations relativement large (au moins aussi élevée que dans les échantillons que vous souhaitez tester). En outre, ce solvant devrait idéalement être assez similaire à la "phase mobile": le solvant utilisé pour transporter les échantillons au moyen de l'instrument de CLHP.
Calculez la quantité d'analyte requise pour préparer une solution "standard" de l'analyte. Ceci est obtenu en multipliant la concentration requise de l'étalon de stock par le volume souhaité. La concentration de l'analyte dans cette solution doit être supérieure d'au moins 10% à la concentration maximale attendue de l'échantillon. Si la concentration de fructose attendue la plus élevée dans un échantillon de boisson gazeuse est de 8 grammes / 100 millilitres, l'étalon de stock peut être ajusté à une concentration de 10 grammes de fructose / 100 millilitres. Un volume raisonnable est de 500 millilitres; 8/100 mL x 500 mL = 40 grammes de fructose seraient donc nécessaires.
Peser la quantité requise d'analyte avec un niveau de précision approprié. Souvent, une valeur pondérale exprimée en grammes avec une décimale ou deux décimales convient, mais une précision accrue peut être nécessaire pour certaines méthodes.
Transférer l'analyte pesé dans une fiole jaugée du volume nécessaire et ajouter le solvant souhaité à la marque de remplissage sur la fiole. L'utilisation d'une fiole jaugée (plutôt que d'un bécher gradué, par exemple) augmente la précision de la valeur de la concentration en standard. Assurez-vous que tout l'analyte est transféré dans le ballon; utilisez une partie du solvant pour le laver, si nécessaire.
Boucher la fiole jaugée et agiter doucement ou inverser jusqu’à dissolution complète de l’analyte.
Réalisez une série de dilutions variées de l’étalon standard en transférant des volumes connus de cet étalon dans des fioles jaugées, en utilisant des pipettes pour un transfert précis, puis en ajoutant du solvant. La concentration standard la plus basse doit être inférieure à l'échantillon anticipé le plus bas à analyser. Dans l'exemple de la boisson gazeuse, si la concentration de fructose attendue la plus basse dans un échantillon est de 2 grammes / 100 ml, vous pouvez créer un étalon de 1 gramme / 100 ml. Cela se ferait par une dilution décuplée de l’étalon. La série d'étalons devrait comprendre un total de 5 ou 6 concentrations, de sorte qu'il faudrait des dilutions supplémentaires pour produire des étalons de 3, 5 et 8 grammes de fructose / ml. Vous disposez maintenant d'une série de solutions standard avec lesquelles étalonner le HPLC.