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La coloration de Gram est une procédure de coloration différentielle qui montre quelles bactéries sont à Gram positif ou à Gram négatif en fonction de leur couleur de coloration. L’acétone alcool est un réactif utilisé dans ce processus pour différencier les couleurs. Les bactéries à Gram positif ont une couche épaisse de peptidoglycane et une coloration pourpre, alors que les microorganismes à Gram négatif ont une couche de peptidoglycane à peu près nulle et sont teintées de rose.
Teinture Primaire - Cristal Violet
Une fois la lame d’échantillon bactérienne préparée, le cristal violet est utilisé pour colorer d’abord l’échantillon. À ce stade, les bactéries à Gram positif et à Gram négatif apparaissent en violet. Généralement, le cristal violet est appliqué sur la lame pendant 30 secondes avant de laver à l'eau tout excès de tache. Le cristal violet peut adhérer un peu aux couches de peptidoglycane afin que toute la tache primaire ne soit pas lavée à l’eau.
Mordant-Iode
L'iode est ensuite ajouté à l'échantillon pendant une minute. Il agit comme un mordant, qui sert à fixer les colorants dans un processus de coloration. L'iode remplit cette fonction en se liant au cristal violet et en créant un complexe insoluble qui adhère beaucoup mieux à la couche épaisse de peptidoglycane trouvée dans les cellules bactériennes à Gram positif que le seul cristal violet. Il n’ya pas d’étape de lavage à l’eau après l’ajout de l’iode.
Décolorant-alcool
L'acétone ou l'alcool éthylique peut être utilisé comme agent décolorant. L'alcool dissout les lipides présents dans la membrane cellulaire externe des bactéries à Gram négatif, permettant ainsi au complexe cristal violet-iode de s'échapper de la couche plus fine de peptidoglycane. L'alcool est ajouté pendant 10 à 20 secondes; il est versé sur la lame jusqu'à ce que tout l'iode soit éliminé et que l'écoulement soit incolore. À ce stade du processus de coloration de Gram, les bactéries à Gram négatif sont incolores, tandis que les bactéries à Gram positif conservent toujours le cristal violet. Une fois l'opération terminée, la lame doit être rincée à l'eau pour arrêter l'effet décolorant.
Contrestain-Safranin
La Safranine est ensuite ajoutée pour augmenter la visibilité et le contraste aux bactéries incolores à Gram négatif. La tache fait apparaître ces bactéries roses au microscope. Etant donné que la tache est ajoutée à l’ensemble de l’échantillon, elle tache également les bactéries à Gram positif, mais la couleur plus foncée du cristal violet cache la couleur rose safranine plus claire. Une fois que l'échantillon de lame a été inondé de safranine pendant environ une minute, de l'eau est utilisée pour laver toute tache en excès qui n'a pas adhéré aux cellules bactériennes.