Contenu
- TL; DR (Trop long; n'a pas lu)
- Tampon et Sel
- Détergents Dissolvants
- Agents chélateurs et inhibiteurs
- Lyse alcaline
Lyse est un mot qui vient du grec et qui signifie simplement "scinder" ou "éclater". Les termes font référence à ce qu'il advient des cellules dans un tampon de lyse, une solution qui les casse pour en extraire le contenu. Les scientifiques utilisent des tampons de lyse pour extraire de l'ADN ou des protéines de cellules à des fins d'analyse, notamment dans le cas des bactéries. Le type de tampon de lyse cellulaire varie en fonction du type d'expérience, bien que les choix suivants soient courants.
TL; DR (Trop long; n'a pas lu)
Les tampons de lyse aident à casser les cellules ouvertes, de sorte que leur contenu peut être consulté ou supprimé. Certains exemples comprennent les sels, les détergents, les agents chélateurs et les inhibiteurs, ainsi que certains produits chimiques alcalins.
Tampon et Sel
Les tampons stabilisent le pH pendant que les cellules se divisent. Le Tris-HCL est l’un des produits chimiques les plus utilisés pour le tamponnage à pH 8. Le HEPES est un autre produit chimique tampon couramment utilisé dans ces expériences. Le sel de chlorure de sodium peut également augmenter la force ionique, la concentration totale de solutés à l'extérieur des cellules. Ce dernier point a une certaine importance car l’eau peut diffuser à travers les membranes cellulaires des régions à faible concentration en soluté aux régions à forte concentration en soluté.
Détergents Dissolvants
Les détergents dissolvent les membranes cellulaires afin que le contenu des cellules puisse s'échapper. La structure moléculaire ont et amphipathique (c'est-à-dire, les molécules avec une extrémité qui interagissent facilement avec les molécules d'eau alors que l'autre extrémité hydrophobe ou "craintive pour l'eau" ne le fait pas). Ils peuvent dissoudre les graisses en formant des micelles, petites grappes où les queues hydrophobes des molécules de détergent sont dirigées vers les molécules de graisse. Les détergents courants comprennent le dodécylsulfate de sodium, ou SDS, NP-40 et tritonX.
Agents chélateurs et inhibiteurs
Les tampons de lyse incluent également généralement des agents chélateurs tels que l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou l'acide éthylèneglycol-tétraacétique (EGTA). Ces produits chimiques se lient aux ions métalliques avec deux charges positives (magnésium et calcium, par exemple), les rendant ainsi indisponibles pour d'autres réactions. De nombreuses ADNs (protéines qui mâchent l'ADN) et des protéases (protéines qui découpent d'autres protéines) ont besoin d'ions de magnésium pour fonctionner. Par conséquent, en les privant de cet ingrédient essentiel, l'EDTA et l'EGTA aident à réduire le niveau d'activité de la protéase ou de l'ADNase. Cependant, ils ne l'excluent pas complètement et certaines protéases ne dépendent pas de cofacteurs de magnésium, aussi les tampons de lyse incluent-ils parfois des produits chimiques appelés inhibiteurs de protéase, qui se lient aux protéases et les empêchent de fonctionner correctement.
Lyse alcaline
La lyse alcaline, une technique très courante pour purifier les plasmides de bactéries, implique trois solutions. Le premier contient du glucose, du tampon tris-HCL, de l'EDTA et des ARNases. Le glucose crée une concentration élevée de soluté en dehors des bactéries, de sorte qu'elles deviennent un peu molles, ce qui les rend plus faciles à lyser. L'EDTA et le tris-HCL fonctionnent comme déjà décrit, tandis que l'ARNase mâchera tout ARN à l'intérieur de la cellule pour le faire disparaître. La deuxième solution lyse réellement les cellules. Celui-ci contient un détergent SDS et NaOH, ce qui élève le pH à 12 ou plus, dénaturant les protéines à l'intérieur de la cellule et entraînant la séparation de l'ADN en brins simples. La troisième solution contient de l'acétate de potassium pour rétablir le pH à un niveau plus neutre afin que les brins d'ADN plasmidique puissent se reconstituer. Pendant ce temps, les protéines dénaturées s'agglutinent et précipitent, tandis que les ions dodécylsulfate se mêlent aux ions potassium pour former un composé insoluble, qui précipite également de la solution.