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ADN
Acide désoxyribonucléique et protéines. L'ADN est organisé en unités appelées gènes, chacun d'eux codant pour un ARN ou une séquence protéique particulière. Les gènes sont étudiés pour en apprendre davantage sur la structure et la fonction biologiques, l'évolution, la maladie et de nombreux autres aspects des systèmes vivants. Pour étudier les gènes en détail, l'ADN doit être isolé et purifié à partir de cellules d'intérêt.
Extraction d'ADN
Bien que l'ADN d'une seule cellule puisse être extrait et étudié, il ne suffit pas de le voir à l'œil nu. Pour obtenir une quantité suffisante pour la mise en file d'attente, plus vous devez travailler avec des cellules, plus il y a de cellules (plusieurs millions).
Les protocoles exacts varient considérablement pour tenir compte des caractéristiques uniques d'échantillons spécifiques, mais les étapes générales sont l'homogénéisation, la lyse, la digestion, la séparation et la collecte. La procédure s’effectue au mieux dans un petit tube en verre ou en plastique (en fonction de la taille de l’échantillon).
Un échantillon est généralement mélangé ou broyé pour bien séparer les cellules les unes des autres. Cela rend les ingrédients cellulaires plus accessibles aux réactifs suivants. Un détergent ou des enzymes sont ensuite ajoutés à l'homogénat pour lyser les membranes cellulaires (et les membranes nucléaires si les cellules sont eucaryotes) pour libérer l'ADN. À ce stade, l'ADN est entouré de protéines, de lipides, de glucides - de tout ce qui était contenu dans les cellules.
Une digestion enzymatique supplémentaire peut être nécessaire pour décomposer les protéines afin qu'elles ne se lient pas à l'ADN et interfèrent avec sa collection. L'ADN est séparé du reste du contenu de la cellule par addition d'alcool froid, pur, d'éthyle ou d'isopropyle. L'ADN n'étant pas soluble dans ces alcools, il se condensera pour tenter de minimiser son contact avec l'alcool. Les ADN condensés sont ensuite recueillis, généralement par centrifugation - ou par mise en bobine.
Enroulement d'ADN
La collecte de l'ADN par mise en bobine est efficace lorsqu'une grande quantité d'ADN est obtenue à partir d'une procédure d'extraction. C’est aussi une excellente méthode de démonstration puisqu’un impressionnant enchevêtrement d’ADN pur est clairement visible.
Pour spouler l’ADN, l’étape de séparation doit être effectuée avec soin. S'il ne fait pas partie du mélange de réactifs de lyse ajouté précédemment, une solution de sel concentrée (chlorure de sodium) doit être ajoutée à la solution avant l'étape d'addition d'alcool. L'alcool froid est lentement versé sur le côté du tube à essai pour former une couche sur la solution aqueuse, en évitant le mélange. Si cela est fait correctement, l'alcool formera sa propre couche au-dessus de la couche salée. Puis vient le bobinage.
Pour collecter l'ADN de la couche salée, placez soigneusement un agitateur en verre à travers la couche d'alcool jusqu'à ce qu'il touche le fond du tube. Faites lentement tourner la tige entre les doigts tout en surveillant l'interface entre les deux couches. Si suffisamment d'ADN est présent, il s'agglomérera à l'interface entre les couches pour former une masse translucide laiteuse. Faites tourner la tige pour enrouler l’ADN autour de celle-ci (c’est la partie à bobiner) et retirez-la du tube. L'ADN peut être transféré dans un autre tube d'alcool pur pour stockage ou analyse ultérieure.