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Dans les réactions chimiques catalysées par une enzyme, cette dernière réduit la quantité d'énergie d'activation nécessaire en se liant temporairement au substrat et en le tournant dans un état contraint. Le k (catalyseur) ou "kcat" pour la réaction fait référence à la constante indépendante de la concentration pour le taux auquel une enzyme particulière peut métaboliser un substrat en une molécule de produit. Pour calculer kcat, les scientifiques ont d’abord mélangé plusieurs tubes à essai avec différentes concentrations de substrat (appelées "dosage enzymatique") et les ont testées à intervalles de temps constants avec un spectrophotomètre afin de mesurer les concentrations croissantes de molécules de produit. Ces données sont ensuite tracées sur un graphique et analysées.
Calcul des vitesses initiales
Tracer un graphique de la concentration du produit en fonction du temps pour les données du premier tube à essai enzymatique. Remarque: l’axe horizontal doit être «temps» et l’axe vertical, «concentration du produit».
Calculez la ligne de régression linéaire pour les points de données tracés à la section 1, étape 1. Tandis que Excel et les calculatrices graphiques permettent de déterminer facilement ce modèle linéaire, vous pouvez obtenir une estimation de la pente des lignes de régression en divisant la différence de concentration de produit entre des données adjacentes. points par leur différence dans le temps.
Enregistrez la pente de la droite de régression linéaire de la section 1, étape 2 comme "vitesse de réaction initiale (Vo)". Remarque: dans le modèle de ligne de régression "= m + b," le coefficient "m" est la pente.
Répétez les étapes 1, 2 et 3 pour le reste des éprouvettes dans le test.
Calcul de Vmax
Tracez l'inverse de la concentration en substrat de chaque tube à essai par rapport à l'inverse de sa vitesse de réaction initiale (section 1, étape 4). Par exemple, si la vitesse initiale d’un tube à essai avec une concentration initiale en substrat de 50 micromolaires (uM) était de 80 µM / s, les inverses seraient de 1/50 µM pour la concentration en substrat et de 1/80 µM / s pour la concentration initiale. rapidité. Remarque: la concentration en substrat inverse doit être située sur l’axe horizontal et la vitesse initiale inverse doit être sur l’axe vertical.
Remarque: la concentration du substrat doit être située sur l’axe horizontal et la vitesse de réaction initiale sur l’axe vertical.
Déterminez la ligne de régression linéaire pour le graphique que vous avez tracé à la section 2, étape 1. Remarque: comme vous devez connaître l’intersection y de la ligne de régression, vous devez entrer les points de la section 2, étape 1 dans Excel ou un calculatrice graphique et utiliser la fonctionnalité de modélisation de régression intégrée.
Divisez 1 par l'intersection en y de la droite de régression linéaire. Cela vous donnera la valeur de l'inverse de Vmax, la vitesse maximale de réaction de l'enzyme. Remarque: si le modèle de régression linéaire prend la forme "= m + b," alors la valeur de "b" serait l'intersection y. Divisez 1 par "b" pour calculer l'inverse de Vmax.
Divisez 1 par le résultat de la section 2, étape 3 pour calculer la valeur réelle de Vmax.
Déterminez la concentration de l'enzyme dans le test d'origine (voir les données brutes). Remarque: la concentration en enzyme est la même pour tous les tubes à essai. seules les concentrations de substrat varient dans l'analyse.
Divisez le Vmax (de la section 2, étape 4) par la concentration en enzyme (de la section 2, étape 5). Le résultat est la valeur de Kcat.