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Le bleu génétique d’une cellule est codé dans son matériel génétique, ou ADN. Comme l'ADN ne quitte jamais le noyau de la cellule, pour que cette information pénètre dans le cytoplasme où résident d'autres protéines et composants biochimiques, il est nécessaire de transcrire d'abord l'ADN en ARN messager (ARNm ou ARN poly (A)). Cet ARNm est ensuite traduit en protéines qui remplissent de nombreuses fonctions de la cellule. Pour détecter ou quantifier des ARNm très rares, fabriquer des sondes pour microréseaux ou construire des banques de molécules d'ADN complémentaires, l'ARNm doit être isolé. Cependant, l'extraction de l'ARN total (c'est-à-dire tout l'ARN dans une cellule) et l'isolement ultérieur de l'ARNm ne sont pas des processus mutuellement exclusifs; le premier doit être effectué pour que l'ARNm puisse être extrait.
Isolement de l'ARNm de l'ARN total
Homogénéisation de TRIzol: l'ARN total comprend tous les ARNm, ARN de transfert, ARN ribosomal et autres ARN non-codants. Pour séparer ceux-ci des autres composants cellulaires, la cellule est d'abord éclatée pour libérer son contenu. Pour ce faire, les cellules remises en suspension sont mises en suspension par centrifugation (centrifugation à grande vitesse) dans le réactif TRIzol (Life Technologies). Les autres versions de TRIzol (comme le réactif TRI d’Ambion) fonctionnent de la même manière.
Isolement total de l'ARN: Une série de centrifugations est utilisée pour séparer les différents composants (protéines, ADN, ARN) de la cellule en couches, ou phases, au sein de la suspension. La phase supérieure, de couleur jaune, est composée de graisse et peut être jetée. La phase désirée est teintée de rouge, contient l'ARN total et est conservée. Après avoir effectué une extraction au phénol-chloroforme et une série de lavages à l'alcool en utilisant de l'isopropanol et de l'éthanol, l'ARN peut être transformé en pastilles pour l'isolement de l'ARNm. Ajoutez des inhibiteurs de la RNase pour empêcher cette enzyme de dégrader l’ARN total.
Extraction d'ARNm: Il est courant d'utiliser un kit pour isoler les ARNm, car les protocoles de laboratoire maison ne génèrent pas de grandes quantités d'ARNm hautement purifiés. Les kits commerciaux incluent Invitrogen FastTrack 2.0 ou le kit d’isolement d’ARN pur Poly (A) d’Ambion. Ces étapes de base sont communes à ces kits:
a) Mélangez le tampon de lyse inhibé par la RNase fourni dans le kit avec jusqu'à 300 microlitres d'ARN total.
b) Chauffer pendant 5 minutes à 65 degrés Celsius, puis refroidir immédiatement l'échantillon sur de la glace pendant une minute.
c) Mélangez ceci avec du chlorure de sodium 0,5 M puis dissolvez complètement l'Oligo dT (acide oligodésoxythymidylique) dans cet échantillon.
d) Centrifuger cet échantillon et récupérer le surnageant, qui est lavé plusieurs fois dans une série de tampons de liaison et à faible teneur en sel fournis dans les kits.
e) Éluer l'ARNm plusieurs fois jusqu'à l'obtention d'un volume spécifié par le kit (par exemple 500 microlitres).
f) Précipiter l'éluat par acétate de sodium et précipitation à l'éthanol. Re-suspendre dans jusqu'à 20 microlitres d'eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC).
g) Conserver à -80 degrés Celsius et vérifier la qualité et la quantité par spectrophotométrie.