Contenu
- Enzymes de restriction et sites de restriction
- La bonne orientation
- La ligature des extrémités collantes nécessite moins d'ADN
- Différentes enzymes peuvent donner la même extrémité collante
Le clonage moléculaire est une méthode biotechnologique courante que tous les étudiants et chercheurs doivent connaître. Clonage moléculaire utilisant un type d'enzyme appelé enzyme de restriction pour couper l'ADN humain en fragments pouvant ensuite être insérés dans l'ADN plasmidique d'une cellule bactérienne. Les enzymes de restriction coupent l'ADN double brin en deux. Selon l'enzyme de restriction, la coupe peut entraîner une extrémité collante ou une extrémité émoussée. Les extrémités collantes sont plus utiles dans le clonage moléculaire car elles garantissent que le fragment d’ADN humain est inséré dans le plasmide dans la bonne direction. Le processus de ligature, ou fusion de fragments d'ADN, nécessite moins d'ADN lorsque l'ADN a des extrémités cohésives. Enfin, plusieurs enzymes de restriction d'extrémité collante peuvent produire la même extrémité collante, même si chaque enzyme reconnaît une séquence de restriction différente. Cela augmente la probabilité que votre région d'ADN d'intérêt puisse être découpée par des enzymes à extrémité collante.
Enzymes de restriction et sites de restriction
Les enzymes de restriction sont des enzymes qui coupent reconnaissent des séquences spécifiques sur de l'ADN double brin et coupent l'ADN en deux à cette séquence. La séquence reconnue est appelée le site de restriction. Les enzymes de restriction sont appelées endonucléases car elles coupent l'ADN double brin, comme c'est normalement le cas pour l'ADN, à des emplacements situés entre les extrémités de l'ADN. Il existe plus de 90 enzymes de restriction différentes. Chacun reconnaît un site de restriction distinct. Les enzymes de restriction clivent leurs sites de restriction respectifs 5 000 fois plus efficacement que d'autres sites qu'ils ne reconnaissent pas.
La bonne orientation
Les enzymes de restriction appartiennent à deux classes générales. Ils ont soit coupé l'ADN dans des extrémités collantes ou des extrémités émoussées. Une extrémité collante a une courte région de nucléotides, les éléments constitutifs de l'ADN, qui est non appariée. Cette région non appariée est appelée un surplomb. Le porte-à-faux est dit collant car il veut et va se coupler avec une autre extrémité collante qui a une séquence de porte-à-faux complémentaire. Les bouts collants sont comme des jumeaux disparus qui cherchent à se serrer dans leurs bras une fois qu'ils se sont rencontrés. D'autre part, les extrémités franches ne sont pas collantes car tous les nucléotides sont déjà appariés entre les deux brins d'ADN. L'avantage des extrémités cohésives est qu'un fragment d'ADN humain ne peut être inséré dans un plasmide bactérien que dans un seul sens. En revanche, si l'ADN humain et le plasmide bactérien ont des extrémités franches, l'ADN humain peut être inséré tête à queue ou queue à tête dans le plasmide.
La ligature des extrémités collantes nécessite moins d'ADN
Bien que l'ADN à bouts de bâtons ait plus de facilité à se retrouver en raison de leur «caractère collant», ni les bouts collants ni les bouts émoussés ne peuvent se fondre en un morceau continu d'ADN. La formation d'un morceau continu d'ADN complètement lié nécessite une enzyme appelée ligase. Les ligases connectent les dorsales des nucléotides aux extrémités collantes ou franches, ce qui donne une chaîne continue de nucléotides. Les extrémités collantes se trouvant plus rapidement en raison de leur attrait, le processus de ligature nécessite moins d’ADN humain et moins d’ADN plasmidique. Les extrémités franches de l'ADN et des plasmides ont moins de chances de se retrouver. Par conséquent, la ligature des extrémités franches nécessite que davantage d'ADN soit introduit dans le tube à essai.
Différentes enzymes peuvent donner la même extrémité collante
Les sites de restriction sont situés dans tout le génome des organismes, mais ne sont pas espacés de manière égale. Dans les plasmides, ils peuvent être modifiés pour être situés les uns à côté des autres. Les scientifiques qui souhaitent découper un fragment d’ADN humain dans le génome humain doivent trouver les sites de restriction situés à l’avant et à l’arrière de la région du fragment. En plus de garantir qu'un fragment d'ADN est inséré dans la bonne direction, différentes enzymes d'extrémité collante peuvent créer la même extrémité collante, même si elles reconnaissent différentes séquences de restriction. Par exemple, BamHI, BglII et Sau3A ont des séquences de reconnaissance différentes mais produisent la même extrémité collante GATC. Cela augmente la probabilité qu'il y ait des sites de restriction aux extrémités collantes qui encadrent le gène d'intérêt humain.