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La spectrophotométrie est un outil précieux en chimie et en biologie. L'idée de base est simple: différentes substances absorbent mieux le rayonnement lumineux / électromagnétique à certaines longueurs d'onde que d'autres. C’est pourquoi certains matériaux sont transparents alors que d’autres sont colorés, par exemple. Lorsque vous faites briller la lumière d'une longueur d'onde donnée à travers une solution, plus sa concentration est élevée, plus elle absorbe de lumière. Pour calculer la concentration, vous devez comparer vos lectures aux lectures correspondant aux normes de concentration connue. La procédure ci-dessous est une procédure assez générique écrite dans l’esprit d’un laboratoire d’enseignement de la chimie, mais elle peut également être modifiée pour d’autres paramètres.
Comme toujours lorsque vous travaillez dans un laboratoire, mettez vos lunettes de protection, vos gants et votre manteau à manches longues pour assurer votre propre sécurité.
Pressez la poire en caoutchouc pour la vider de l’air, puis placez-la au-dessus de votre pipette graduée et laissez-la se détendre pour aspirer de l’eau dans la pipette. Ensuite, retirez l'ampoule et refermez le haut de la pipette avec votre doigt; cela scellera la pipette de sorte que la solution à l'intérieur ne coule pas jusqu'à ce que votre doigt soit retiré. Soulevez légèrement le bord de votre doigt pour laisser un peu de solution s'écouler de la pipette jusqu'à atteindre le volume souhaité. Entraînez-vous avec de l'eau et un bécher pour comprendre le fonctionnement de la pipette graduée. Le lien sous la section Ressources contient un extrait du film qui vous montre comment utiliser une pipette si vous n’avez jamais travaillé avec une pipette.
Étiquetez 5 tubes à essai comme standards 1-5. Vous pouvez les étiqueter avec du ruban adhésif et un stylo ou avec un marqueur effaçable à sec.
Choisissez cinq concentrations pour vos normes. Vous souhaitez que les concentrations standard soient séparées les unes des autres à peu près au même intervalle - par exemple, 0,1 molaire, 0,2 molaire, 0,3 molaire, etc. - et à peu près dans le même intervalle que celui que vous espériez connaître. Pour le moment, utilisez les cinq concentrations suivantes, mais n'oubliez pas que vous devrez les modifier lorsque vous réaliserez votre propre expérience:
Standard 1: 0,1 molaire Standard 2: 0,2 molaire Standard 3: 0,3 molaire Standard 4: 0,4 molaire Standard 5: 0,5 molaire
Ensuite, prenez la solution standard 1 molaire et ajoutez les quantités suivantes aux tubes à essai 1-5. N'oubliez pas que ces quantités sont calculées à l'aide des concentrations répertoriées ci-dessus. Vous devrez donc peut-être les modifier si nécessaire lors de votre propre expérience.
Standard 1: 0,8 millilitre Standard 2: 1,6 millilitre Standard 3: 2,4 millilitres Standard 4: 3,2 millilitres Standard 5: 4 millilitres
Rincer la pipette graduée, puis transférer les quantités suivantes d’eau désionisée:
Standard 1: 7,2 millilitres Standard 2: 6,4 millilitres Standard 3: 5,6 millilitres Standard 4: 4,8 millilitres Standard 5: 4,0 millilitres
En gros, l’idée est d’amener la quantité de solution dans chaque tube à 8 millilitres.
Couvrez chacun des tubes standards avec du parafilm et inversez-les pour les mélanger.
Marquez cinq autres éprouvettes comme "Inconnu 1-5". Ajoutez les mêmes quantités de votre solution inconnue ou de votre solution d’essai à chacune des solutions que vous avez utilisées avec la solution 1 molaire pour les étalons. En d’autres termes, unknown 1 contiendra 0,8 millilitre de solution d’essai et 7,2 millilitres d’eau, unknown 2 contiendra 1,6 millilitre de solution d’essai et 6,4 millilitres d’eau, et ainsi de suite.
Couvrez chacune des inconnues avec du parafilm et inversez soigneusement pour mélanger.
Allumez le spectrophotomètre et laissez-le se réchauffer. La durée nécessaire dépendra du modèle et du fabricant.
Définissez la longueur d'onde sur le spectrophotomètre. La longueur d'onde dépend du type de produit chimique utilisé dans votre expérience. Pour le moment, supposons 500 nm, mais souvenez-vous que vous devrez changer cela pour différentes expériences.
Calibrez votre spectrophotomètre. La procédure d'étalonnage varie en fonction de l'appareil que vous utilisez. Pour le Spectronic 20, un modèle courant dans les laboratoires d’enseignement, vous devez d’abord ajuster la machine pour qu’elle affiche "0% T" lorsqu'aucune cuvette n’est chargée, puis réglez-la de manière à lire "100% T" lorsqu’une cuvette vierge contenant des éléments désionisés seule l'eau est chargée. Ces procédures peuvent varier en fonction du type de machine que vous utilisez, consultez les instructions du fabricant pour plus de détails.
Une fois la machine calibrée, prenez l’éprouvette standard 1 et versez le contenu dans une cuvette propre jusqu’à atteindre la ligne de remplissage. Essuyez la cuvette avec un Kimwipe pour enlever les doigts ou autres saletés. Insérez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez la lecture "% T".
Répétez cette procédure pour les 10 échantillons. SOYEZ CERTAIN de nettoyer la cuvette entre les échantillons pour vous assurer que vos résultats sont aussi précis que possible.
Prenez les résultats pour vos standards et entrez-les dans un tableur / programme graphique comme Excel ou OpenOffice.
À l'aide du tableur, divisez 100% par chacune des valeurs "% T" des normes, puis consignez le journal du résultat. Ce calcul vous donnera l'absorbance. Si vous entrez la formule, votre tableur effectuera le calcul pour vous.
Exemple: si le% T est égal à 50,6, la formule que vous avez entrée dans le tableur serait la suivante:
log (100 / 50.6)
Le programme de tableur fera l’arithmétique.
Faites la même chose pour les cinq valeurs inconnues / expérimentales.
Représentez graphiquement les valeurs d'absorbance pour les cinq standards, avec la concentration en abscisse et l'absorbance en ordonnée. À l’aide du tableur, ajustez une équation linéaire à ce graphique. L'équation sera de la forme y = mx + b. La plupart des tableurs auront une fonction de régression linéaire. Consultez le manuel de l'utilisateur de votre tableur pour plus d'informations sur l'utilisation de la fonction de régression linéaire.
Prenez l'équation de la meilleure ligne de votre tableur et résolvez-la pour y en soustrayant b des deux côtés et en divisant les deux côtés par m. Le résultat ressemblera à ceci:
(y - b) / m = x
où b et m sont les valeurs trouvées par votre tableur.
Vérifiez vos valeurs d'absorbance pour les inconnues et choisissez-en trois qui tombent à peu près dans les mêmes limites que les normes. Utilisez ces trois valeurs d’absorbance pour vos calculs restants. Si les cinq se situent dans la même plage que les normes, vous pouvez les utiliser à la place, mais vous devez en utiliser au moins trois.
Branchez chacune des trois valeurs d'absorbance dans votre équation à la place de y. Rappelez-vous que votre équation était sous la forme suivante:
(y - b) / m = x
Donc, vous voudrez insérer la valeur d'absorbance pour chaque inconnue dans l'équation à la place de y, puis calculer x. Vous pouvez utiliser le tableur pour effectuer ce calcul pour vous et le rendre plus rapide. Vous avez maintenant calculé la concentration de la substance chimique d'intérêt dans trois de vos inconnus dilués. Toutefois, la solution d'origine a été diluée pour préparer ces inconnues. Vous devez donc maintenant travailler en arrière et calculer la concentration de la solution d'origine en fonction du facteur de dilution.
Chaque échantillon inconnu que vous avez inséré dans le spectrophotomètre a été dilué avec une quantité différente. Par conséquent, vous devez maintenant diviser la concentration que vous avez calculée en fonction de l'absorbance pour chaque lecture inconnue comme suit:
Inconnu 1: Diviser par 0,1 Inconnu 2: Diviser par 0,2 Inconnu 3: Diviser par 0,3 Inconnu 4: Diviser par 0,4 Inconnu 5: Diviser par 0,5
Rappelez-vous cependant que ces chiffres sont basés sur l'hypothèse selon laquelle vous utilisez les dilutions décrites ci-dessus. N'oubliez pas de modifier ces valeurs si vous avez dilué vos échantillons d'une quantité différente.
Additionnez vos résultats et divisez-les par le nombre de résultats. Cela vous donnera une moyenne. Signalez ce nombre en tant que résultat pour la concentration de la solution d'origine.