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La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) est une technique de laboratoire utilisée pour séparer et identifier les composés. C'est un type de chromatographie sur colonne qui repose sur différentes polarités de composés dans une solution afin de les séparer. La HPLC diffère de la chromatographie sur colonne standard car elle utilise la pression pour forcer la solution à travers la colonne plus rapidement et produit donc des résultats plus rapides et parfois plus précis. L'objectif est de séparer les composés dans la colonne et de les faire sortir séparément.
La coelution
En raison de la rapidité de la HPLC et de sa dépendance à différentes polarités de composés, deux composés de structure et de polarités similaires peuvent sortir de l'appareil de chromatographie en même temps ou presque. Ceci est connu sous le nom de coelution. La coelution permet de déterminer exactement quelle partie du mélange est éluée à quel point il est difficile.
Composés adsorbés
La HPLC utilise généralement une colonne de verre remplie de billes de différents matériaux. Les mélanges qui sont forcés à travers la colonne contiennent des produits chimiques qui se lient avec des forces différentes aux billes. La force de la liaison, qui dépend de la similarité de polarité, détermine la durée pendant laquelle le produit chimique va se lier à la perle avant d'être libéré. Certains composés se lient si fortement qu'ils ne sont pratiquement jamais libérés des billes de la colonne et ne sont jamais mesurés dans la solution sortant de la colonne.
Coût
Les techniques de séparation de laboratoire typiques impliquent le développement d'un test ou d'une méthode de séparation, puis la mise en œuvre de ce test pour séparer des composés individuels d'une solution. Cependant, il en résulte généralement plusieurs solutions qui doivent également être soumises à des procédures, ce qui entraîne une augmentation exponentielle de la complexité. Bien que la HPLC puisse souvent simplifier et accélérer ce processus, le coût de développement d’un appareil HPLC peut devenir énorme. Développer un appareil HPLC, bien que beaucoup plus efficace, est beaucoup plus coûteux que de développer d’autres tests pour la séparation des composés. Cela le rend non viable financièrement pour de nombreux petits laboratoires privés.
Complexité
La CLHP n'est pas seulement utilisée pour séparer des composés simples, mais également pour isoler des protéines spécifiques d'un mélange cellulaire. Dans ce cas, les perles de la colonne sont généralement recouvertes d'un anticorps spécifique de la protéine à collecter. Les protéines se lient aux anticorps et la solution restante est passée à travers la colonne, puis les protéines sont libérées à l'aide d'une autre solution et collectées. Cela nécessite un technicien hautement qualifié pour surveiller la colonne à tout moment et s'assurer que le processus se déroule exactement comme prévu.